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Latin American Journal of Biotechnology and Life Sciences
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2022.07.04.52
Files > Volume 7 > Vol 7 No 4 2022


Efecto de los hongos formadores de micorriza arbuscular (HFMA) en la producción de aceites esenciales en romero (Rosmarinus officinalis L.)
Effect of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) on essential oil production in rosemary (Rosmarinus officinalis L.).
Jorge A. Sierra-Escobar 1*, Manuela Márquez Arteaga 2, Clara Quiroz 3
1. Docente Asociado, grupo de estudios florísticos, Facultad de Ingenierías Universidad Católica de Oriente (UCO) . Colombia
2. Estudiante de Agronomía Universidad Católica de Oriente. Colombia
3. Ingeniera Química, docente Universidad Católica de Oriente. Colombia
*Corresponding author. [email protected]
Available from: http://dx.doi.org/10.21931/RB/2022.07.04.52

 
RESUMEN

Se realizó una campaña experimental en invernadero con el fin de evaluar el efecto de los hongos formadores de micorriza arbuscular (HFMA) en la producción de aceites esenciales en romero (Rosmarinus officinalis L.). Para el efecto se implementó un diseño experimental completamente al azar, con tres tratamientos compuestos por suelo más inóculo multiespórico (Glomus spp, Acaulospora spp,  Entrophosfora spp, Scutellospora spp.), suelo más inóculo monoespórico (Entrophosfora colombiana), y el tratamiento control sin inocular, todos estos con diez repeticiones por tratamiento. El suelo utilizado para todas las unidades experimentales fue esterilizado y ajustado a 0,02 mg L-1 de P (fósforo), concentración óptima para la condición micorrizal. Las variables respuesta fueron: contenido de P foliar, la masa seca aérea, la colonización micorrizal, y el rendimiento en aceites esenciales. Los resultados de masa seca aérea indican incrementos significativos de los tratamientos inoculados comparados con el tratamiento control. El P foliar no presento diferencias entre tratamientos. La colonización micorrizal promedio de los tratamientos inoculados fue del 73%. En cuanto a los aceites esenciales producidos por las plantas de romero, los resultados fueron inversos a los de la masa, donde se evidencio mayor rendimiento en el tratamiento control. De acuerdo con los datos, el uso de HFMA en la producción de romero, favorece el desarrollo de la planta, de otro lado, el rendimiento en aceites esenciales podría ser compensado por la mayor biomasa producida, lo que permitiría a los productores incrementar la cantidad de aceite extraído.
 
Palabras clave: aceites esenciales, hongos micorrízicos arbusculares, Rosmarinus officinalis
 
 
ABSTRACT

 
An experimental greenhouse campaign was conducted to evaluate the effect of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) on the production of essential oils in rosemary (Rosmarinus officinalis L.). For effect, a completely randomized experimental design was implemented, with three treatments composed of soil plus multisporic inoculum (Glomus spp, Acaulospora spp, Entrophosfora spp, Scutellospora spp.), soil plus monosporic inoculum (Entrophosfora colombiana), and the control treatment without inoculation, all of these with ten replicates per treatment. The soil used for all experimental units was sterilized and adjusted to 0.02 mg L-1 of P (phosphorus), the optimum concentration for the mycorrhizal condition. The response variables were: foliar P content, aerial dry mass, mycorrhizal colonization, and essential oil yield. The results of aerial dry mass indicate significant increases in the inoculated treatments compared to the control treatment. Leaf P showed no differences between treatments. The average mycorrhizal colonization of the inoculated treatments was 73%. As for the essential oils produced by the rosemary plants, the results were the inverse of those of the mass, where a higher yield was found in the control treatment. According to the data, the use of HFMA in the production of rosemary favors the development of the plant; on the other hand, the yield of essential oils could be compensated by the higher biomass produced, which would allow producers to increase the amount of oil extracted.
 
Keywords: essential oils, arbuscular mycorrhizal fungi, Rosmarinus officinalis.
 
 
INTRODUCCIÓN

 
El Romero (Rosmarinus officinalis) es una planta aromática de origen mediterráneo, que pertenece a la familia Lamiaceae, sus hojas presentan altas concentraciones de aceites esenciales con propiedades anti microbiales 1,2, se ha utilizado para incrementar la circulación de la sangre, y es efectiva contra reumatismo y migraña 3. Debido a su importancia y demanda internacional, el cultivo de romero se ha incrementado en todo el mundo. En Colombia, una de las regiones con mayor potencial para el cultivo de esta planta es el altiplano del oriente antioqueño (AOA). Los suelos del AOA donde se produce romero, generalmente tienen características de Andisoles, suelos desarrollados a partir de materiales provenientes de erupciones volcánicas (ceniza, pómez, lava, etc.) y/o de materiales volcaniclásticos en los que la fracción coloidal está dominada por minerales de bajo rango de ordenamiento o por complejos Al-humus 4. Los materiales de estos suelos le dan unas características únicas y distintivas, llamadas propiedades ándicas, las cuales se manifiestan en una baja densidad aparente, una alta carga variable y una alta capacidad de retención de fosfatos y de humedad 5. En general, los Andisoles del AOA se han desarrollado bajo régimen de humedad údico caracterizados por presentar, en la capa arable, pH fuertemente ácido, alto contenido de materia orgánica, colores muy oscuros, alta carga variable, bajos contenidos de bases intercambiables y de fósforo disponible, además de desbalances entre las bases y contenidos de Al intercambiable 6. El fósforo, elemento que es esencial en la fotosíntesis, la respiración celular y en el metabolismos energético de la planta 7 se hace menos disponible  cuando el suelo es de origen Ándica, es por esto que  las plantas tienen que desarrollar mecanismos especializados para la toma de este elemento, uno de estos mecanismos, es la necesidad de realizar simbiosis benéficas con microorganismos del suelo como los hongos formadores de micorrizas, los cuales juegan un gran papel al hacer rápida la disponibilidad de este elemento y de otros para el buen funcionamiento fisiológico de las plantas 8.
 
La palabra micorriza, se deriva del griego myco, que significa hongo, y rhiza, que hace referencia a las raíces de las plantas. Se podría decir que es una simbiosis mutualista formada entre los órganos de absorción sanos (raíces y rizomas), se cree que entre 86% al 94% de las plantas del mundo poseen simbiosis con algún tipo de micorriza 9, ya sean terrestres, epífitas o acuáticas 10. Existes varios tipos de micorriza, los principales son: micorrizas arbusculares, ericoides, orquidioides, y ectomicorrizas. Las micorrizas arbusculares, son el tipo más cosmopolita, el cual se encuentra en aproximadamente el 74% de las plantas con flor del mundo 9. Se caracteriza por la integración estructural y metabólica entre ambos simbiontes que se manifiesta en la nutrición, sanidad, productividad y adaptabilidad de las plantas a las condiciones ambientales 11. Se encuentran en la literatura numerosos artículos que demuestran la efectividad de los hongos formadores de micorriza arbuscular (HFMA) para mejorar el rendimiento y productividad de las plantas 12, 13, 14. Estas ventajas que dan a las plantas los HFMA en el rendimiento vegetal, se están utilizando con mayor frecuencia por parte de los cultivadores de diversos cultivos agrícolas. Incluso, algunos productores de romero del AOA utilizan con frecuencia inóculos comerciales de HFMA, con el fin de aumentar la productividad.  El efecto positivo de HFMA en romero ya ha sido probado en estudios llevados a cabo por investigadores de Egipto e Irán, dando como resultado incrementos significativos en el crecimiento de las plántulas evaluadas, es de aclarar que ambos estudios se realizaron en condiciones de suelo diferentes 15, 16. Sería interesante conocer si en las condiciones del AOA, la aplicación en el suelo de HFMA incrementaría la biomasa y productividad del romero. Y si esto favorece también su concentración en aceites esenciales. Por tal motivo, el presente estudio pretende conocer la respuesta de romero a la inoculación de hongos formadores de micorriza arbuscular (HFMA) en el rendimiento en biomasa, y la concentración de aceites esenciales.
 
 
MATERIALES Y MÉTODOS

 
Localización
 
El experimento se realizó en uno de los invernaderos de la Universidad Católica de Oriente (6° 9´ 15.2” N, 75° 22´ 10.4” W y altitud de 2112 m) ubicado en la cordillera central de los Andes (Rionegro, Colombia). El sitio presenta, una temperatura promedio de 17°C y una precipitación anual de 2200 mm con régimen bimodal dos periodos de lluvia y dos secos. Además, el invernadero se encuentra en la zona de vida bosque húmedo montano bajo 17

 
Suelo
 
Se utilizó un suelo orgánico (Andisol), el cual tenía características similares al suelo de las áreas cultivadas de romero del AOA. Éste suelo fue usado como materia prima para todos los análisis y ensayos posteriores. Los 499 kg de suelo que se utilizaron, se desinfectaron en caldera, donde se vaporizaron a 90 psi y a 90oC durante dos horas, esto con el fin de eliminar los microorganismos patógenos, semillas y propágulos vegetales indeseados.

 
Análisis físico-químico del suelo
 
Submuestras de suelo fueron utilizadas para realizar varios análisis como la isoterma de adsorción de P, que fue elaborada con base en la metodología propuesta por Fox & Kamprath 18, los resultados de este procedimiento sirvieron para ajustar el suelo a 0,02 mg L-1 de P (concentración óptima para la condición micorrizal). Además, se realizó un análisis de suelos de fertilidad en el laboratorio de suelos de la Universidad Nacional Sede Medellín (tabla 1). Aquello sirvió para ajustar los  niveles de Mg y S  que presentaban deficiencias, para lo cual se aplicó 12,31 g MgSO4 por kilogramo de suelo. Los métodos analíticos utilizados para el análisis de suelos fueron: textura (Bouyucos), pH (agua, 1:1, v:v), materia orgánica % (Walkley y Black), Calcio, Magnesio y  Potasio cmolc kg -1  (Acetato de Amonio 1M, pH 7), Fósforo (Bray II); Hierro, Manganeso, Cobre y Zinc mg kg-1 (Olsen – EDTA); Boro no detectable mg kg-1 (Agua Caliente); Nitrato mg kg-1 (Sulfato de Aluminio 0.025M) y Amonio mg kg-1 (KCl 1M).
 

 
Tabla 1. Análisis fisicoquímico del suelo utilizado para el experimento
 

       
 
Inóculos y análisis biológico
 
Para los tratamientos se trabajaron dos inóculos micorrizales, uno monoespórico (Entrophosfora colombiana) y otro multiespórico compuesto por especies de los géneros Glomus spp, Acaulospora spp, Entrophosfora spp, y Scutellospora spp.
 
Para garantizar la efectividad de los inóculos de HFMA y homogenizar su aplicación en los diferentes tratamientos, se realizaron conteos de esporas y se utilizó la técnica del número más probable de propágulos micorrizales infectivos (NMP) propuesta por Porter 19 para hongos micorrizales. El conteo de esporas se realizó para conocer el número de esporas por gramo de cada inóculo. Para el efecto cada muestra se transfirió a un vaso de precipitación con 300 mL de agua corriente y 0,15 g de pirofosfato de sodio. Se agito y se dejó decantar pasando el sobrenadante por una batería de tamices (250, 106 y 53 µm). Se centrifugó con una solución de sacarosa al 50% durante 5 minutos; el sedimento fue recogido del tamiz en un embudo cubierto con papel filtro. Finalmente se realizó el conteo en estereoscopio separando los morfotipos más representativos.  Por otro lado, se determinó NMP. Para esto se utilizó un sustrato compuesto por una mezcla esterilizada compuesta por suelo (50%) y arena (50%), que se llevó a una concentración de P soluble de 0,02 mg L-1 por medio de una isoterma (tal como se explicó anteriormente). La especie indicadora fue Leucaena leucocephala, ampliamente utilizada para este fin 20. Para el montaje, se emplearon diluciones de 10-1 a 10-5 cada una con 5 repeticiones por dilución. Para un total de 25 unidades experimentales por muestra de inóculo. Cada unidad experimental estaba compuesta por 20 g de inóculo y de 180g de sustrato esterilizado. Una vez germinadas las semillas fueron colocadas en los potes con su respectiva dilución, aplicándoles semanalmente la solución nutritiva Hoagland libre de P hasta el final del experimento. Posteriormente, las plántulas de L. leucocephala se cosecharon a los 65 días y se les realizó tinción de raíces de acuerdo con lo propuesto por Kormanik et al. 21. La observación de la raíces se realizó en el estereoscopio con la técnica de presencia-ausencia y los resultados se analizaron con la tabla de Cochran 22. De acuerdo con los resultados del NMP se aplicaron 13,4 g/kg de suelo de A. colombiana, y 12,69 g/kg de suelo de inoculo multiespórico.
 

Material vegetal
 
Se escogió el genotipo R2 de romero producido por la Unidad de Biotecnología de la Universidad Católica de Oriente y se multiplicaron vegetativamente por la técnica de enraizamiento de mini esquejes, de los cuales se tomó material vegetal entre 3 y 5 cm. Este material fue propagado en bandejas de germinación con un sustrato compuesto por turba más cascarilla de arroz quemada en relación 2:1 esterilizado, utilizando para el efecto la metodología propuesta por Castro et al. 23
 

Diseño experimental
 
El diseño experimental fue completamente al azar, el cual estaba compuesto por tres tratamientos: el tratamiento 1 (A. colombiana), tratamiento 2 (inoculo multiespórico) y el tratamiento 3 (control sin inocular) (Tabla 2). Cada tratamiento tuvo 10 réplicas. La unidad experimental correspondió a una plántula de romero contenida en una caneca plástica con capacidad de 20 litros de agua, la cual fue llenada con 12 kg de suelo más su respectivo tratamiento. El total de unidades experimentales fueron 30.
 
La cosecha del experimento tuvo dos períodos de tiempo: el primero para realizar la evaluación del fósforo foliar, la masa aérea seca y el porcentaje de colonización (cosecha a los 119 días después de la siembra) en la cual se cosecharon 15 unidades experimentales, cinco por tratamiento. Y el segundo periodo tuvo la finalidad de producir mayor masa (100 g por unidad experimental como mínimo) requeridos para la extracción del aceite, y la masa seca aérea (nuevamente), la última cosecha ocurrió a los 280 días después de la siembra y con las 15 unidades experimentales restantes.
 
 

 
Tabla 2. Nomenclatura para los tratamientos
 

 
Análisis estadístico
 
Para el análisis estadístico se realizaron las pruebas de normalidad de Kolmogorov-Smirnov y Shapiro-Wilk. Además, los datos fueron sometidos a análisis de varianza y a la prueba de rangos múltiples de Duncan, para lo cual se empleó un nivel de significancia P £  0,05. Se utilizó para estos análisis el paquete estadístico Statgraphics Centurión XVII y Rwizard 1,0.

 
Variables respuesta
 
Contenido de P foliar. Se estimó a través de la concentración de P en el disco de hoja al momento de la cosecha 24, en donde se analizó el contenido de P en las hojas jóvenes completamente desarrolladas 20. Para tal fin, una porción circular del tejido foliar se removió con un perforador (6 mm de diámetro). El contenido de P se expresó en términos de µg por disco de hoja. El P se determinó por el método del azul de molibdato 25, luego de reducir los discos de hoja a cenizas en la mufla a 500°C por 3 h. Este método de muestreo no destructivo fue originalmente propuesto por Aziz y Habte 26.

 
Masa seca aérea
 
Para determinar la masa seca aérea, cada plántula se cortó en el cuello de la raíz, se secó el material vegetal en horno a 60 °C por 72-96 horas (hasta obtener un peso constante) y finalmente se pesó cada unidad experimental. Este procedimiento se realizó en dos momentos, a los 119 y a los 280 días después de la siembra.

 
Colonización micorrizal
 
Para la colonización micorrizal, se tomaron submuestras de 0,6 a 1 g de raíces finas de cada unidad experimental, se lavaron y se cortaron aproximadamente a 1 cm de longitud, las cuales se sumergieron en una solución de KOH al 10% para su aclaración, durante 24 horas, después se acidificaron en una solución de  HCl (10%) 27, y se tiñeron con fucsina ácida al 0,15 % en ácido láctico con base en la metodología propuesta por Kormanik et al. 21.  Para la cuantificación de la colonización, se extienden 20 raicillas en un portaobjetos, cada raicilla se leyó en tres puntos (arriba, abajo y en el medio), se observaron al microscopio en 10X y 40X, y se marcaron las estructuras micorrícicas observadas (esporas, hifas y arbúsculos) que equivalen a los campos colonizados, y los campos observados son la totalidad de campos, independientemente de que estén colonizados o no. El porcentaje de colonización se calculó con la fórmula 28
 
 
% colonización micorrizal = No. de campos colonizados         * 100
 
                                              No. total de campos observados
 
 
Rendimiento en aceite esencial
 
A las 15 plantas restantes se les extrajo el aceite por medio de la técnica de hidrodestilación con trampa de Clevenger. El tiempo estimado para la extracción fue de 2 horas y 56 minutos. Una vez obtenido el aceite fue secado con sulfato de sodio anhidro. El rendimiento en la extracción se expresó en ml de aceite esencial/100 g de materia seca.
 
 
RESULTADOS

 
La concentración de P foliar no presentó diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos, aunque el tratamiento control (sin inoculación) presento un valor ligeramente superior de 5,0 mg de P por disco (Tabla 3).


 
Tabla 3. Contenido de P en los discos de hoja de romero en función de la concentración de P en la solución del suelo y la inoculación micorrizal.
 
 
No se presentaron diferencias significativas (LSD, P £ 0.05) entre los promedios comparados.
 
En cuanto a masa seca aérea, en la primera cosecha (119 días después de la siembra) se presentaron diferencias significativas entre todos los tratamientos, con valores superiores en MSA a favor de los tratamientos inoculados, con valores de 42,5 y 34,5 para E. colombiana y Comercial respectivamente. En la segunda cosecha (280 días después de la siembra), se continuo con la misma tendencia, en donde los inóculos exhibieron diferencias significativas (Figura 1). Estos resultados evidencian un efecto positivo de los HFMA en romero, siendo el tratamiento 1 (inóculo monosporico con E. colombiana), el que presentó mejor efectividad.
 


 
 
Figura 1. Masa seca aérea (MSA) de los diferentes tratamientos aplicados a romero en función de la inoculación micorrizal, y en dos momentos de cosecha. Columnas con letras disimiles indican diferencias significativas (Duncan, P  £ 0,05).
 
 
La colonización micorrizal fue similar en los tratamientos 1 y 2, con valores de 77 y 69% respectivamente. Mientras qué, el tratamiento 3 (control) presentó colonización del 4,7%, muy por debajo de los demás tratamientos. La colonización en el tratamiento control se debe, posiblemente, al tamaño de los potes utilizados (que facilitan la diseminación de esporas) y al ambiente confinado del invernadero (Tabla 4).
 


 
Tabla 4. Porcentaje de colonización micorrizal
 

 
El rendimiento en aceite esencial evaluado mediante la técnica de destilación por arrastre de vapor con trampa Clevenger, tuvo diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos T3 (control) yT1 (E. colombiana) con valores de 2,17 y 1,775 ml 100g-1 respectivamente. De acuerdo con los datos, no hubo efecto indirecto de la inoculación de HFMA en romero en cuanto al rendimiento en la extracción de aceite (Tabla 5).


 
Tabla 5. Rendimiento en la extracción de aceite
         

 
DISCUSIÓN

 
Los resultados indican que romero (Rosmarinus officinalis) respondió bien a la inoculación de HFMA, lo cual mejoró significativamente la masa seca aérea. La respuesta positiva, en cuanto a masa, de plantas de romero inoculadas ha sido ampliamente reportada, aunque en condiciones diferentes. Por ejemplo, Sanchez-Blanco 29 evaluaron R. officinalis en condiciones de estrés hídrico y observaron que las plantas micorrizadas tuvieron incrementos significativos en masa seca aérea. En otro estudio en Irán, conducido por Bahonar et al. 15 y en condiciones salinas, R. officinalis respondió bien a la inoculación micorrizal, con incrementos significativos en masa. Lo mismo ocurrió en suelos calcáreos de Egipto, en donde Shehata et al. 16 evaluaron diferentes microorganismos (HFMA, Bacillus megatherium, Azospirillum brasilense) y sus mezclas y encontraron respuesta positiva a la inoculación en cuanto a la masa, sobre todo cuando las mezclas incluían HFMA. La anterior información confirma que R. officinalis puede adaptarse bien a diferentes condiciones de suelo, pero para hacerlo requiere de los HFMA.  
 
Al igual que la masa, la colonización micorrizal en romero ha sido ampliamente estudiada, los porcentajes de colonización micorrizal varían dependiendo del mico simbionte, pero en general R. officinalis responde bien a la mayoría de ellos. Valores entre 20 y 70% de colonización han sido reportados 30 . Lo que está en concordancia con los resultados aquí obtenidos (Tabla 5.).
 
La relación de los HFMA con metabolitos secundarios se encuentra estudiada, y se ha reportado que dependiendo de la especie de planta se favorecen los HFMA. Por ejemplo en Valeriana officinalis., Salvia officinalis., Trifolium pratense.y Origanum vulgare  los HFMA mejoraron su productividad, incluyendo la acumulación de metabolitos secundarios, aunque es de resaltar que este comportamiento depende de la especie de planta31. Además, se ha encontrado que los flavonoides, estimulan el crecimiento de los hongos micorrizales 32. Otros autores han observado en raíces de plantas micorrizadas, cambios en la biosíntesis de metabolitos secundarios 33, los cuales van desde la acumulación de flavonoides 34 triterpenoides 35, ciclohexanona y apocarotenoides 36, fitoalexinas 37 y compuestos fenólicos 38, es decir que los HFMA tienen un efecto fisiológico en los metabolitos secundarios producidos por las plantas. En este sentido, los cambios en las raíces colonizadas de R. officinalis pueden afectar la producción de aceites esenciales de forma diferencial, por ejemplo, en el presente estudio no hubo respuesta positiva en el rendimiento de aceites esenciales y su concentración, resultados similares encontró Bagheri et al. 39, en donde evidenciaron incrementos significativos en la masa seca cuando se inocularon las plantas de romero con Glomus  intraradices y G. mosseae, cosa que no ocurrió con los aceites esenciales. De otro lado, Bahonar et al. 15 observaron incrementos en masa y aceites esenciales cuando inocularon plántulas de romero en condiciones salinas. Igual tendencia presento Shehata et al. 16 en suelos calcáreos utilizando la mezcla de HFMA, Bacillus megatherium y Azospirillum brasilense. La anterior información sugiere que los mecanismos que estimulan el incremento en la producción de aceites esenciales en las plantas de R. officinalis no son claros, y pueden ser diferenciales, ya que sus efectos cambian dependiendo de las condiciones del suelo y del mico simbionte utilizado.

 
CONCLUSIONES

 
Las plántulas micorrizadas exhibieron diferencias significativas en cuanto a biomasa en los dos períodos evaluados, es decir a los 199 y 280 días después de la siembra. Sin embargo, el mayor rendimiento en aceites esenciales lo presento el tratamiento control (sin inocular), lo que sugiere que los HFMA disminuyen la concentración en los tejidos de romero de estos aceites. Es de aclarar, que, si se tiene en cuenta la cantidad total de biomasa de los tratamientos inoculados, el aceite producido para el cultivador sería mayor, por lo cual sería recomendable la micorrización de las plántulas para incrementar la producción de romero.
 
 
AGRADECIMIENTOS

 
Agradecemos el apoyo económico de la Dirección de Investigación y Desarrollo de la Universidad Católica de Oriente.
 
También agradecemos al grupo de Estudios Florísticos y a los programas de Ingeniería Ambiental y Agronomía de la misma Universidad, que siempre estuvieron prestos a orientarnos en todo momento.
 
 
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Received: January 25, 2022 / Accepted: October 22, 2022 / Published:15 November 2022

 Citation: Sierra-Escobar J A, Arteaga M M, Quiroz C. Efecto de los hongos formadores de micorriza arbuscular (HFMA) en la producción de aceites esenciales en romero (Rosmarinus officinalis L.). Revis Bionatura 2022;7(4) 52. http://dx.doi.org/10.21931/RB/2022.07.04.52  
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