2023.08.04.22
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Evaluación de la viabilidad, estabilidad y pureza post liofilización en diferentes modelos fúngicos de la Colección de Microorganismos de la Escuela de Microbiología de la Universidad de Antioquia, Colombia
Evaluation of viability, stability and purity after lyophilization in different fungal models from the Microorganisms Collection of the Escuela de Microbiología of the Universidad de Antioquia, Colombia
Daniela
Montoya-Arango 1,5
, Maria Paula Quintero-Rodriguez 2,5, Deisy
Cristina Restrepo-Posada 3,5, Diana Marcela González-Gil 4,5*
, Maria Paula Quintero-Rodriguez 2,5, Deisy
Cristina Restrepo-Posada 3,5, Diana Marcela González-Gil 4,5*1 Escuela de
Microbiología, Universidad de Antioquia, calle 67 No. 53 – 108,
Medellín-Colombia; [email protected].
2 Escuela de
Microbiología, Universidad de Antioquia, calle 67 No. 53 – 108,
Medellín-Colombia; [email protected].
3 Facultad de
medicina, Universidad de Antioquia, Cra. 51D No. 62-29, Medellín-Colombia; [email protected].
4 Colección de
Microorganismos, Escuela de Microbiología, Universidad de Antioquia, calle 67
No. 53 – 108, Medellín-Colombia; [email protected].
5 Grupo de Investigación Microbiología Básica
y Aplicada (MICROBA), Escuela de Microbiología, Universidad de Antioquia, calle
67 No. 53 – 108, Medellín-Colombia
* Correspondencia: [email protected]
Available from. http://dx.doi.org/10.21931/RB/2023.08.04.22
RESUMEN
Uno de los retos de las colecciones biológicas vivas
consiste en preservar microorganismos viables, puros y estables con el empleo
de diferentes métodos. Entre ellas, las colecciones de hongos cumplen un papel
fundamental al resguardar y documentar la biodiversidad y el recurso genético
fúngico. Los métodos que se recomiendan para cumplir con estos objetivos a
largo plazo son la criopreservación y liofilización. La Colección de
Microorganismos de la Escuela de Microbiología de la Universidad de Antioquia
requiere evaluar la liofilización para preservar hongos, dado que bajo
condiciones óptimas puede mejorar algunas limitaciones de otros métodos
empleados. En esta investigación se liofilizó una levadura y tres hongos
filamentosos durante 24 horas empleando diferentes sustancias protectoras y se
evaluó la viabilidad, pureza y estabilidad antes y después de liofilizar. Los
resultados evidenciaron que en la mayoría de los hongos la viabilidad,
estabilidad y pureza fue exitosa usando sacarosa al 10% con un inóculo
aproximado de 108 células/mililitro a una temperatura de 80°C bajo
cero y 6 pascales de presión. Aunque la sacarosa fue el lioprotector que
presentó mejor porcentaje de viabilidad, mantuvo estables y puros a los
microorganismos, y cumplió con las características físicas del producto seco,
los demás lioprotectores constituyen una alternativa válida de uso.
Palabras clave: conservación; colecciones fúngicas; hongos;
levaduras; liofilización; preservación.
ABSTRACT
One of the challenges of living biological collections is to
preserve viable, pure and stable microorganisms using different methods. Among
these, fungal collections play a fundamental role in protecting and documenting
fungal biodiversity and genetic resources. The recommended procedures to meet
these long-term goals are cryopreservation and freeze-drying. The Collection of
Microorganisms of the Escuela de Microbiología of the Universidad de Antioquia
needs to evaluate freeze-drying for preserving fungi because it can improve
some limitations of other methods used under optimal conditions. In this
research, one yeast and three filamentous fungi were freeze-dried for 24 hours
using different protective substances, and the viability, purity and stability
were evaluated before and after freeze-drying. The results showed that viability,
stability and purity were satisfactory for most fungi using 10% sucrose as a lyoprotectant
with an inoculum of approximately 108 cells/milliliter at a
temperature of 80°C below zero and 6 pascals of pressure. Although sucrose was
the lyoprotectant that presented the best percentage of viability, kept the
microorganisms stable and pure, and complied with the physical characteristics
of the dry product, the other lyoprotectants constitute a valid alternative for
its use.
Keywords: conservation; fungal collections; fungi; yeast; freeze-drying;
preservation.
INTRODUCCIÓN
Las colecciones fúngicas cumplen un papel
fundamental como reservorio de la Funga de nuestro planeta y la preservación de
cepas con potencial desarrollo biotecnológico en la industria y la salud,
proporcionando la base esencial, representada en recursos genéticos y
biodiversidad, para industrias ecoeficientes de biotecnología emergentes.
Adicionalmente, su uso en docencia e investigación cobra importancia cuando el
material biológico se almacena debidamente identificado, evaluando
periódicamente su pureza, viabilidad y estabilidad.1 En nuestro
caso, esto favorece el proceso de aprendizaje de más de 200 estudiantes al
semestre a partir de cepas que conservan sus características originales a
través del tiempo, criterio que también debe cumplirse en investigación para
garantizar la fiabilidad y reproducibilidad de los resultados, otorgando gran
relevancia a la elección de métodos de preservación adecuados. Con el objetivo
de minimizar la pérdida de hongos, se sugiere almacenar cada microorganismo por
dos métodos, idealmente por criopreservación o liofilización puesto que
minimizan los riesgos de modificación genética.2
Actualmente, la Colección de
Microorganismos de la Escuela de Microbiología de la Universidad de Antioquia
(CM-EM-UDEA) conserva las especies fúngicas en agua, repique seriado o por
criopreservación a -80ºC, sin
embargo, estos métodos presentan algunas limitaciones como la viabilidad a
corto y mediano plazo, el cambio de características macroscópicas y
microscópicas, el riesgo biológico aumentado, contaminaciones frecuentes, poco
espacio para almacenamiento y la necesidad de adquirir ultracongeladores de
manera constante para garantizar un buen número de alícuotas en cada
microorganismo.3 Lo anterior tiene un alto costo y una dependencia
de conexión eléctrica para mantener bajas temperaturas, lo cual no es seguro en
nuestro laboratorio dado que periódicamente hay inestabilidad en la energía o
se debe suspender para realizar mantenimiento de la red eléctrica. En otros
laboratorios, si bien no se utilizan ultracongeladores, las muestras se
criopreservan en tanques de nitrógeno líquido, generando altos costos por el
suministro periódico del mismo.4 Adicionalmente, la ultracongelación
parece tener un efecto bastante lesivo en ciertos hongos dado que algunos
crioprotectores resultan tóxicos y sus estructuras tienen mayor susceptibilidad
a la formación de cristales durante el proceso, lo que evidencia la necesidad
de establecer opciones de métodos de preservación que se adapten a cada tipo de
microorganismo.4
A pesar de que clásicamente la preservación
de hongos se ha llevado a cabo mediante subcultivos seriados, almacenamiento en
aceite mineral, en agua estéril o en gel de sílice, son métodos dispendiosos,
preservan a corto o mediano plazo, tienen alto riesgo de contaminación, son
bioinseguros por manipular microorganismos metabólicamente activos y no
garantizan la estabilidad genética.3,4 En contraste, la
liofilización es un método de preservación a largo plazo que favorece la
estabilidad genética, el transporte y el almacenamiento, y si bien se debe usar
un equipo costoso, es suficiente para preservar altas cantidades y múltiples alícuotas
de microorganismos. El proceso consiste en la detención del metabolismo celular
mediante la ultracongelación inicial de la muestra, paso esencial para permitir
que el solvente se separe de los componentes celulares y de las sustancias
protectoras mediante la formación de cristales de hielo, que posteriormente
será eliminado en el segundo paso llamado sublimación, en este, la muestra
inicia el secado por evaporación del agua a muy baja temperatura y presión de
vacío. Finalmente, se realiza un secado definitivo para obtener una muestra
desecada que mantiene la estabilidad celular y es fácilmente reconstituida.5
Durante las diferentes etapas de este método de preservación, las
estructuras celulares pueden sufrir daños, siendo fundamental la elección y
estandarización de sustancias protectoras que mitiguen dicho deterioro para
alcanzar condiciones óptimas en el proceso; entre las más usadas se encuentran
carbohidratos, polímeros, péptidos y sustancias antioxidantes. Las condiciones
previas del microorganismo como la concentración de la muestra también tienen
impacto en el resultado del proceso; previamente se ha establecido que concentraciones
por encima de 1x108 células/ml permite una óptima recuperación
celular. Así mismo, establecer un tiempo y temperatura de liofilización adecuada
mejora las características del producto seco y reduce el daño celular, esto
depende del tipo de producto y la concentración de la muestra, a mayor complejidad
celular se requiere mayor tiempo de liofilización y menor temperatura, a menudo
por debajo de -50 °C o lo más cercana a la temperatura de congelación inicial para
optimizar el proceso de sublimación; no obstante, dado que la temperatura
depende también de la presión de vapor dentro de la cámara de liofilización,
mantener una presión de vacío menor a 10 pascales garantiza este equilibrio
durante todo el proceso; 5-7 teniendo en cuenta lo anterior y las
características del liofilizador 8 se definieron los parámetros del
proceso.
Aunque la liofilización es un método
ampliamente usado en bacterias, su uso en micología es menos extendido y las
investigaciones en este campo tienen limitaciones metodológicas por la alta
diversidad entre los hongos y, consecuentemente, una gran variabilidad de
estructuras morfológicas incluso en una misma especie, lo cual puede afectar de
forma importante la viabilidad y estabilidad fenotípica y genotípica.4,9,10
Por esta razón, seleccionamos diferentes modelos de hongos a partir de los
cuales se pudieran extrapolar los resultados. Candida albicans es una levadura que hace parte de la microbiota de
piel y mucosas, también puede causar infecciones vulvovaginales, cutáneas,
onicomicosis y otras infecciones sistémicas principalmente en personas
inmunodeficientes, con capacidad de afectar casi cualquier órgano o sistema
corporal. No obstante, también es usada en la industria para producción de
biomasa, y dada su similitud con otras levaduras nuestros resultados son
relevantes para aplicarlos en la preservación de levaduras de importancia en
salud o de amplio uso en la industria alimentaria.11 En el mismo
sentido, los resultados de la preservación de Aspergillus sección Nigri,
uno de los hongos filamentosos más importantes en la biotecnología industrial y
en investigaciones de generación renovable de materia prima para la producción
de biocombustibles, permitirá, no solo preservar sus características genéticas
originales y modificadas, sino también extrapolar hacia otros hongos
ambientales con importancia industrial o en investigación clínica por ser
agentes de micosis profundas o productores de enzimas y productos metabólicos
usados en medicina. 12,13 Por otro lado, Trichophyton mentagrophytes hace parte de los hongos dermatofitos,
responsables de las principales afecciones de piel, cuero cabelludo y uñas en
todo el mundo, representando un alto costo para los sistemas de salud, por
consiguiente, la preservación de dicho grupo clínico es de gran relevancia en
docencia, investigación de tratamientos, pruebas de identificación y
diagnóstico.14 Finalmente, Rhizopus
sp. Representa los hongos filamentosos no septados, su preservación adecuada
tiene relevancia en docencia e investigación clínica porque son causantes de
micosis profundas e infecciones oportunistas graves en el ser humano, así como
importancia en la industria alimentaria y farmacéutica.15,16
Publicaciones previas, en algunas especies
de hongos, han mostrado buenos resultados con la liofilización, no obstante,
existe inconsistencia según las estructuras micóticas preservadas, las
características evaluadas o la forma de reportar los resultados, 10, 17-21
por lo que se requiere estandarizar un protocolo de liofilización que se pueda
aplicar de forma satisfactoria y homogénea a la mayoría de los hongos que se
encuentran almacenados en la CM-EM-UDEA. En este sentido, el objetivo de este
estudio fue evaluar la viabilidad, estabilidad y pureza post liofilización en Trichophyton mentagrophytes, Rhizopus spp., Aspergillus sección Nigri
y Candida albicans, hongos de la
Colección de Microorganismos de la Escuela de Microbiología de la Universidad
de Antioquia, utilizando diferentes sustancias protectoras.
MATERIALES Y MÉTODOS
Microorganismos evaluados
Se evaluaron un dermatófito, un moho
aseptado, un moho septado y una levadura a partir de aislados clínicos de la
CM-EM-UDEA (Trichophyton mentagrophytes,
Rhizopus spp. Aspergillus sección Nigri)
y una cepa de referencia (Candida
albicans ATCC 14053).
Activación de
microorganismos
La activación metabólica de los hongos se
hizo realizando dos repiques de manera consecutiva a partir del método de conservación.
Se empleó Agar Sabouraud Dextrosa (SDA, por su sigla en inglés) (Becton,
Dickinson and Company, Sparks, USA) para el primer y segundo repique para C. albicans y para los hongos
filamentosos se usó Agar Papa Dextrosa (PDA, por su sigla en inglés) (MCD Lab,
Oaxaca, México) en el segundo repique con fin de estimular la esporulación. La
temperatura de incubación fue de 28 a 30 °C durante 48 horas para C. albicans, 96 horas para Aspergillus sección Nigri y Rhizopus spp., y
120 horas para T. mentagrophytes.
Sustancias protectoras
Se realizaron cinco evaluaciones con tres
lioprotectores: leche descremada 10%, glucosa 10%, sacarosa 10%, leche
descremada + glucosa 10%, leche descremada + sacarosa 10%, (% p/v).
Estandarización del inóculo
Para la levadura se realizó una curva de
crecimiento en el equipo Multiskan GO (Thermo Fisher, Massachusetts, USA) con el fin de identificar la fase de crecimiento exponencial tardía. A
partir del segundo repique de C.
albicans, se ajustó un patrón 1 McFarland en medio líquido de infusión
cerebro corazón (siglas en inglés BHI) (Merck, Bogotá, Colombia) y a partir de
éste se realizó una dilución 1:10, se inocularon 200 µl en un plato Corning
U-buttom y se introdujo en el equipo programado a 37°C, en agitación constante
a velocidad media (parámetro del equipo), a 620 nm y con lecturas cada 30
minutos durante 24 horas. El mismo patrón McFarland diluido se replicó con
mayor volumen (110 ml) en agitación constante a 200 rpm, a 37°C en simultáneo a
la curva de crecimiento hasta detectar la fase exponencial tardía en el equipo.
Cuando alcanzó dicha fase, se distribuyó el volumen total en 6 alícuotas
iguales para ser centrifugadas a 3500 rpm durante 20 minutos. Después de
retirar el sobrenadante se reconstituyó cada alícuota con 4 ml de las
diferentes preparaciones de los lioprotectores y luego se distribuyeron en dos
tubos, cada uno con 2 ml de suspensión para liofilizar. Un tubo adicional se
reconstituyó con 2 ml de caldo BHI para evaluar el efecto de la liofilización
en la levadura cuando no se adicionó una sustancia protectora; finalmente, se
preparó otro tubo con 2 ml de cada lioprotector sin microorganismo como control
de pureza.
Para los hongos filamentosos se aplicó el
mismo protocolo (en caldo Sabouraud, a 25°C) con el fin de identificar dicha
fase, sin embargo, por la reducción de conidias observadas durante el tiempo de
incubación se modificó el procedimiento con el fin de favorecer la esporulación
y posteriormente se estandarizó el inóculo a liofilizar mediante lavado de
conidias. Para lo anterior, después del tiempo de incubación en agar PDA, se
verificó la esporulación y se realizó un lavado de conidias de cada
microorganismo con 2 ml de TWEEN 80 al 0.01% (Suquin, Bucaramanga, Colombia) y
se ajustó al patrón 1 McFarland con caldo extracto de levadura 1% (p/v) (Merck,
Bogotá, Colombia). La suspensión se dividió en 6 tubos de ensayo con 4 ml cada
uno y se centrifugaron a 3500 rpm durante 20 minutos; después de precipitar la
biomasa se realizó el mismo procedimiento descrito para la levadura.
Los tubos a liofilizar fueron congelados en
inclinación con el fin de formar una capa delgada y optimizar los resultados de
la liofilización, a una temperatura de -80 °C durante un tiempo no menor a 20
horas.
Liofilización
La liofilización se llevó a cabo en un
liofilizador Labconco Freezone plus 2.5 (Marshall Scientific, Hampton, USA),
programado a -80 °C, a una presión de 6 pascales, durante 24 horas.
Reconstitución de los
liofilizados
Después de liofilizar se reconstituyó con 2
ml de caldo BHI para C. albicans y 2
ml de extracto de levadura 1% para los hongos filamentosos.
Evaluación de la viabilidad
Antes y después de liofilizar se sembraron
10 µL de forma cuantitativa y por duplicado, la levadura en agar BHI, durante
48 horas a 25°C; los hongos filamentosos en SDA, incubando Trichophyton mentagrophytes a 30 °C; Aspergillus sección Nigri
y Rhizopus spp. a 28 °C durante 120
horas. Tras el periodo de incubación se hizo el cálculo de Unidades Formadoras
de Colonia por mililitro (UFC/ml) y para el conteo de hongos filamentosos se
hizo una revisión periódica cada 24 horas durante 120 horas, en ambos casos se
realizó el conteo de cada replica y se calculó en número promedio. Posteriormente se calculó el porcentaje de
viabilidad para cada hongo en cada lioprotector, empleando las siguientes fórmulas:19
Donde:
Xi = número de
UFC / ml antes de liofilizar
Xf = número de
UFC / ml después de liofilizar.
Evaluación de la
estabilidad
Antes y después de liofilizar, se realizó
tubo germinal a C. albicans y en
todos los hongos, incluyendo los filamentosos, se enfatizó en la comparación de
las características macroscópicas (visualización de las colonias) y
microscópicas (visualización de estructuras micóticas con azul de lactofenol
con objetivo microscópico de 10x y 40x), para identificar cambios fenotípicos
de las cepas evaluadas que pudieran ser explicadas por el proceso de
liofilización. Lo anterior, partiendo de los medios de cultivo para recuento de
UFC/ml antes y después de liofilizar.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El presente proyecto de investigación
detalla la información encontrada durante la estandarización del proceso de
liofilización de hongos, aportando evidencia científica no solo en la
viabilidad de los microorganismos, sino también sobre su estabilidad y pureza,
lo cual es difícil hallar de manera unificada en estudios publicados, dado que
la mayoría solo reportan viabilidad o parámetros en forma cualitativa. 17-19
Además, los microorganismos evaluados en este estudio son modelos específicos
que permiten ampliar el alcance de los resultados a otros hongos compatibles,
con fisiología o estructuras micóticas similares.
En cuanto a la estabilidad de los hongos
evaluados, no se observaron cambios microscópicos o macroscópicos
significativos. En C. albicans, el tiempo para alcanzar la fase exponencial tardía
necesaria para el inóculo inicial de la liofilización fue de 12 horas; antes de
liofilizar se obtuvieron colonias blancas, cremosas, de borde definido y tamaño
mediano (Figura 1A-B); microscópicamente se observaron levaduras de tamaño
variable, unigemantes (figura 1C-D) y el tubo germinal fue positivo (figura
1E-F); ninguna de estas características se modificó tras la liofilización. Para
los hongos filamentosos se mantuvieron las mismas características antes y
después de liofilizar. T. mentagrophytes
con colonias blancas, algodonosas, de borde definido (figura 2A-B);
microscópicamente tenía hifas septadas hialinas delgadas, sin espirales y
microconidias piriformes (figura 2C-D); Rhizopus
spp. tuvo un crecimiento en toda la caja de cultivo, con micelio aéreo abundante
y color gris oscuro (figura 3A-B), microscópicamente se observaron los
característicos rizoides, esporangias esférica de pared gruesa, que al romperse
daban la apariencia de sombrero chino y esporangiosporas ovaladas pigmentadas
color café (figura 3C-D). Las colonias de Aspergillus
sección Nigri eran negras con aspecto
punteado sobre un fondo blanco en el anverso (figura 4A-B), microscópicamente
se observaron cabezuelas radiadas, fértiles en toda la superficie, con
bifiálides, conidias globosas y equinuladas color café (figura 4C-D).
Figura 1. Candida
albicans. Cultivo
antes (A) y después de liofilizar (B). Morfología microscópica (aumento 400x)
antes (C) y después de liofilizar (D), usando azul de lactofenol como colorante;
tubo germinal positivo (flechas) antes (E) y después de liofilizar (F).
Figura 2. T.
mentagrophytes. Morfología macroscópica antes (A) y después (B) de liofilizar. Morfología
microscópica (aumento 400x) antes (C) y después de liofilizar (D), usando azul
de lactofenol como colorante.
Figura 3. Rhizopus sp. Morfología macroscópica antes (A) y
después (B) de liofilizar. Morfología microscópica (aumento 100x) antes (C) y
después (D) de liofilizar.
Figura 4. Aspergillus sección Nigri. Morfología macroscópica antes (A) y después (B) de
liofilizar. Morfología microscópica (aumento 100x) antes (E) y después (F) de
liofilizar.
Los porcentajes de viabilidad (figura 5)
fueron mayores al 70% cuando se usó glucosa como lioprotector, excepto para T. mentagrophytes que fue alrededor del
50%, similar a la viabilidad con leche descremada para este microorganismo; de
hecho, comparativamente con los demás hongos éste tuvo menor viabilidad en la
mayoría de los lioprotectores. Lo contrario se observó con C. albicans en la que todos los lioprotectores presentaron
viabilidad del 100%, excepto leche descremada; inclusive su viabilidad fue
completa cuando solo se usó caldo de cultivo durante la liofilización,
resultado observado también en Rhizopus
spp., aunque en este último es llamativo que con lioprotectores como glucosa,
sacarosa y leche descremada con sacarosa, el porcentaje de viabilidad se redujo
alrededor de 20% y la reducción fue mayor con las otras sustancias. En Aspergillus sección Nigri, la viabilidad fue alrededor del 70% con sacarosa y glucosa y
cuando se combinaron éstos con leche descremada estuvo entre 40% y 50%,
respectivamente. Cabe resaltar que no se obtuvo crecimiento en las alícuotas
donde se usó sólo las sustancias protectoras evidenciando la pureza del proceso.
Los lioprotectores fueron elegidos por
asequibilidad, uso frecuente y efectividad.22 Como se mencionó en el
párrafo anterior, la leche descremada, lioprotector ampliamente usado puesto
que sus componentes inhiben la formación de cristales y protege las membranas
celulares de los microorganismo liofilizados, no tuvo los altos porcentajes de
viabilidad esperados en este estudio y aunque diferentes autores 17-18,23 reportaron altos resultados de viabilidad,
estabilidad y pureza cuando liofilizaron hongos con éste y otros
lioprotectores, se basaron en la presencia o ausencia de crecimiento de los
microorganismos, mediante ensayos por duplicado, triplicado o con una sola
replica; dificultando la comparación con los resultados obtenidos en este
estudio puesto que además de reportar crecimiento en todos los lioprotectores
también se calculó el porcentaje de viabilidad. Para algunos hongos, el
porcentaje de viabilidad mejoró cuando se combinó leche descremada con glucosa
y sacarosa, aunque fue menor comparada con el uso de azúcares como lioprotectores
solos; Ávila et al.19
reportaron resultados similares cuando se utilizó leche descremada con miel
como lioprotector y Burguet et al.24
cuando emplearon leche descremada; ambos evidenciaron una marcada disminución
de la viabilidad en el tiempo, efectos no deseados que pudieran atribuirse a
este lioprotector.
También fueron evaluados carbohidratos como
lioprotectores, sustancias que regulan la deshidratación, aumentan la
resistencia a bajas temperaturas y presiones y estabilizan las membranas
celulares.25 En este ensayo, lo hongos presentaron mejor viabilidad
con glucosa 10%, sin embargo, esta última no tuvo las propiedades físicas
generales y la velocidad de reconstitución recomendadas; este resultado podría
haberse presentado al sobrepasar el valor crítico de temperatura y presión para
este carbohidrato, produciéndose burbujeo, deshidratación incompleta, interrupción
de la sublimación, pérdida de rigidez del producto final y apariencia no
satisfactoria.25 Aunque no se halló ningún cambio en las
características morfológicas antes y después de liofilizar, sería importante
que futuros estudios evalúen el uso de la glucosa en concentraciones menores al
10%, además de las características físicas e higroscópicas durante el
almacenamiento para determinar el efecto en la viabilidad, estabilidad y pureza
de los microorganismos en el tiempo, variable que también debe evaluarse con
los demás lioprotectores.
Con la sacarosa también se obtuvieron altos
porcentajes de viabilidad para todos los hongos evaluados, obteniéndose un
producto seco con las características adecuadas; todos los microorganismos se
aislaron 100% puros y con un alto grado de estabilidad, por lo tanto, la
sacarosa se convierte en un lioprotector promisorio para elegir en nuestra
colección, máxime la comparativa costo efectividad que tiene frente a la
trehalosa, con el que también se ha reportado efectos benéficos en la
viabilidad micótica. 20-21,26
Figure 5. Porcentajes de viabilidad de los hongos con cada
lioprotector evaluado
Es llamativo que la liofilización solo con
BHI y extracto de levadura conservaron adecuadamente la viabilidad de C. albicans y Rhizopus spp., respectivamente, con resultados del 100% y sin
cambios fenotípicos significativos; lo que podría deberse a que estos medios de
cultivos contienen componentes que se usan comúnmente como sustancias
protectoras durante este proceso, evidenciando el potencial uso de estos caldos
de cultivo como lioprotectores, teniendo en cuenta su relación costo-beneficio,
amplia disponibilidad en los laboratorios y fácil preparación.27
Durante el establecimiento de las
condiciones óptimas de liofilización, no se utilizó curva de crecimiento en los
mohos ya que durante el ensayo se evidenció que a medida que pasaba el tiempo
de incubación se disminuía la formación de estructuras que resisten mejor el
proceso de liofilización como esclerocios, conidias o esporas, resultado que no
favorece el proceso.28 Henao et al.,29 también reportaron
una tendencia a la disminución en el recuento de conidias durante la curva de
crecimiento en medio líquido y en agitación, con aumento en la biomasa,
mostrando que el medio de cultivo líquido aporta a los hongos filamentosos las
condiciones nutricionales para el desarrollo vegetativo, favoreciendo en menor
medida el estadio reproductivo;30 en este sentido, para estos
microorganismos, recomendamos priorizar la esporulación en un medio adecuado
más que a la fase de crecimiento, estandarizando el inóculo para tener un
protocolo controlado durante la liofilización que reduzca las variaciones.
Como
limitaciones del estudio, se debe considerar que, aunque se estandarizó un
protocolo que garantizó viabilidad, estabilidad y pureza después de liofilizar
con las sustancias protectoras evaluadas, sería importante evaluar el efecto
que tiene el almacenamiento a largo plazo en la estabilidad del producto seco
y, específicamente para C. albicans, evaluar si el uso de caldo de
extracto de levadura, peptona y dextrosa (YPD por sus siglas en inglés) mejora
la viabilidad post liofilización, al ser un medio de cultivo ampliamente usado
en hongos. Adicionalmente, incluir análisis de fisiología y métodos moleculares
de estabilidad genética, además de características morfológicas, permitiría
identificar con mayor precisión los cambios que puede generar el proceso de
liofilización en los hongos.
CONCLUSIONES
A pesar de la naturaleza inestable de
algunos hongos, este ensayo de liofilización garantizó viabilidad, estabilidad
y pureza de los microorganismos evaluados, estandarizado a temperatura de -80
°C, presión de 6 pascales, densidad celular inicial aproximada de 3 x 108
UFC/ml y tiempo de liofilización de 24 horas; reportando parámetros de forma
cuantitativa que permiten obtener resultados más objetivos y la comparación más
precisa entre estudios de preservación fúngica.
Pese a que la glucosa fue el lioprotector
que en general tuvo mayor viabilidad, sus características físicas finales hacen
necesario evaluar diferentes concentraciones y junto con las demás sustancias
protectoras, evaluar su impacto en el almacenamiento a largo plazo, incluyendo
el desempeño de los caldos de cultivo como lioprotectores dado su favorable
relación costo/beneficio, teniendo en cuenta que para la liofilización de
hongos filamentosos recomendamos la utilización de un medio de cultivo que
estimule la producción de conidias previo al procedimiento de preservación. Nuestros
resultados evidenciaron que la sacarosa 10% fue el lioprotector que presentó
mejor porcentaje de viabilidad, mantuvo estables y puros a los microorganismos,
y cumplió con las características físicas del producto seco, sin embargo, los
demás lioprotectores constituyen una alternativa válida según la disponibilidad
y necesidades de cada laboratorio.
Contribución
de los autores: Todos los autores contribuyeron al diseño,
adquisición, análisis e interpretación de los datos, redacción y revisión del
artículo y aprobación de la versión a publicar.
Financiamiento: Esta investigación recibió recursos de
financiación del Centro de Investigación de la Escuela de Microbiología de la
Universidad de Antioquia, Colombia.
Consejo de Revisión Institucional: No aplica.
Consentimiento informado: No aplica.
Agradecimientos:
Las autoras
agradecen al Centro de Investigación de la Escuela de Microbiología de la
Universidad de Antioquia y al grupo de investigación Microbiología Básica y
Aplicada, especialmente a su Línea de Epidemiología Molecular por el apoyo
recibido y los espacios brindados. Así mismo, a la Colección de Microorganismos
por los recursos y disposición durante el desarrollo de este trabajo de
investigación.
Conflicto de
intereses: Las autoras declaran no tener conflicto de intereses durante la
realización de este proyecto de investigación.
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Received: 28 September 2023/ Accepted: 15 November 2023 / Published:15
December 2023
Citación: Montoya-Arango, D.; Quintero-Rodríguez M.; Restrepo-Posada, D.;
González-Gil, D. Evaluación de la viabilidad, estabilidad y pureza post
liofilización en diferentes modelos fúngicos de la Colección de Microorganismos
de la Escuela de Microbiología de la Universidad de Antioquia, Colombia.Revis Bionatura 2023;8 (4) 22. http://dx.doi.org/10.21931/RB/2023.08.04.22